@misc{oai:repo.qst.go.jp:00070251,
 author = {石井, 伸昌 and 鏡味, 麻衣子 and 石井 伸昌},
 month = {Sep},
 note = {はじめに
　これまでに精力的に研究されてきている‘微生物ループ’では、ウイルス、細菌、従属栄養鞭毛虫、それに繊毛虫といった微生物が水域の炭素循環において重要な生物であることを明らかにしてきた。このように、水域の物質循環において、微生物は極めて重要な役割を担っている。ところが、同じ微生物でも水棲の真菌類は、この微生物ループの考えにおいて考慮されてこなかった。おそらく真菌類の現存量が高くないと考えられていたためであろう。
　近年、大型植物プランクトンから動物プランクトンへの物質の流れを真菌類の一種であるツボカビが担っている可能性が示唆された。ツボカビは鞭毛を持って運動する胞子（遊走子）を形成する真菌であり、この遊走子の形や大きさは鞭毛虫のそれと似ている。そのため、これまで鞭毛虫として計数されていた値には、ツボカビの遊走子が含まれている可能性がある。ツボカビの現存量を見積もり、生態学的役割を評価するためには、先ずツボカビを検出することが重要である。
　本研究では、ツボカビを含む真菌類を検出する方法として、分子生物学的手法による検出を検討した。本検討において、真菌類の群集構造を網羅的に把握できる可能性のある変性剤濃度勾配電気泳動（PCR-DGGE）法の利用、その後の配列決定、系統解析、そして帰属分類の推定を考慮した。
\n材料と方法
　真菌類のモデルとしてSaccharomyces cerevisiae JCM1499およびツボカビの一種であるZygorhizidium planktonicumを用いた。また、千葉県の印旛沼から採水し、これを環境サンプルとした。DNAの回収にはISOIL for Beads Beatingを用いた。抽出DNAを用いて真菌の18S rRNA遺伝子配列の一部を増幅する条件を検討した。プライマーは約500 bp程度の配列長が得られることを目標に、14種類のプライマーを用い10組のプライマーセットについて検討した。さらに、PCR増幅の効率化にために、アニーリング温度、ウシ血清アルブミンの効果、プライマーの濃度についても検討した。
\n結果と考察
　はじめに選定したプライマーとZ. planktonicum（Accession No. FJ799984）の配列の相同性について検討した。用いた14種類のプライマーのうち、EF4とfung5rを除き、プライマーの配列はZ. planktonicumの配列と完全一致した。EF4は20塩基のうち18塩基が、fung5rは19塩基のうち17塩基が一致した。
　10種類のプライマーセットについて検討したところ、EF4/fung5rとBMB-BR/EF3rの両セットがバンドのシャープさ、増幅効率、配列長の点で優れていた。従って、以降はこの２つのプライマーセットを用いてさらなる検討を行った。
　両プライマーセットにおける最適アニーリング温度について検討した結果、EF4/fung5rは47℃、BMB-BR/EF3rは55℃が最適であることが分かった。さらに、PCR反応液にウシ血清アルブミンを添加することにより、増幅効率は飛躍的に増すことが分かった。
　PCR-DGGE法を行うためにfung5rおよびEF3rの5’-末端側にGCクランプを付け、先に求めた条件でPCRを行ったが、両プライマーセットともPCR産物はほとんど得られなかった。検討の結果、GCクランプ付きのプライマーを用いる場合、通常よりも鋳型となるDNA量を増やす必要があることが分かった。さらに、プライマーの濃度を濃くすると増幅効率が良くなる場合があることが分かった。, 日本陸水学会第75回大会},
 title = {PCR-DGGE法におる水生 菌類検出のためのプライマーの検討},
 year = {2010}
}