@misc{oai:repo.qst.go.jp:00061952,
 author = {道川, 祐市 and 菅原, 圭亮 and 藤本, 健太郎 and 木下, 健司 and 菅, 智 and 大塚, 好美 and 藤原, 一彦 and 岩川, 眞由美 and 今井, 高志 and 道川 祐市 and 菅原 圭亮 and 菅 智 and 荘司 好美 and 岩川 眞由美 and 今井 高志},
 month = {Dec},
 note = {プライマー伸長反応はPCR等様々な分子生物基盤技術に応用されている。しかしながら、伸長開始段階での塩基識別特異性が低いためSNPや変異等の検出には複雑な工程を必要とする。これは伸長開始反応を触媒するDNAポリメラーゼの性質に起因し、プライマー・テンプレート複合体間に１塩基のミスマッチが存在していても、通常は若干の反応効率低下を示すだけで伸長反応を進行させてしまう。特にチミンとグアニン間のミスマッチはほとんど影響を与えないことが報告されている。塩基識別特異性を伸長開始段階で獲得させることができれば非常に簡便であり、かつその後の伸長反応における工夫次第で多様な応用が考えられる。本研究ではプライマー伸長開始反応の塩基識別特異性向上を図りSNPタイピング法に応用することを目的とした。
　塩基識別特異性を検証する対象SNPとして、放射線感受性との相関が報告されている３遺伝子（APEX1、TGFB1、SOD2）のSNPを選択した。その中には上述のチミンーグアニン置換SNPが含まれている。伸長反応用プライマー配列は３’末端塩基がSNP部位と対合するように設計した。塩基識別特異性を向上させる手法としては、ミスマッチ挿入法と３’末端修飾塩基挿入法を試行した。その塩基識別特異性への影響評価は、遺伝子型既知の正常健常人由来ゲノムDNA２５名分をリアルタイムQPCR法により解析し、各SNPアレル認識プライマーのCtを求めることで行った。その後、伸長反応用プライマーの５’末端部にアミノ基を付加してプラスチック基板上に固定化し、塩基識別特異性の再検証を行った。
　その結果、ミスマッチ挿入法では特異性向上の認められない例もあったが、３’末端修飾塩基挿入法では安定して特異性向上が認められることがわかった。アレル間でのCtの違い（ΔCt）もミスマッチ挿入法では最高１２サイクルであったが、３’末端修飾塩基挿入法では２０サイクルを越える例もあり、チミンーグアニン置換SNPも問題なく識別することができた。この塩基識別特異性はプライマーをプラスチック基板上に固定しても再現されることが確認された。アレル特異的プライマー伸長開始反応を利用すると、リアルタイムQPCR法では反応開始から３０分程度のごく短時間にSNP判定を行うことが可能であった。一方プラスチック基板上での反応においては、ビオチン標識した塩基を伸長反応の過程で複数個取り込ませることで、肉眼でもシグナル検出可能なレベルまで感度向上を果たすことができた。, 日本分子生物学2006フォーラム},
 title = {プライマー伸長開始反応の塩基識別特異性向上とSNPタイピングへの応用：高速・簡便リアルタイムQPCR法とプラスチック基板DNAチップ法},
 year = {2006}
}